氟譜定量方法
合成工作中氫譜定量大家已經(jīng)很熟悉，使用也比較普遍。但是，氫譜作為一種定量手段有很多缺點：1）氫譜的化學(xué)位移帶寬很窄，大部分集中在0-10 ppm或0-12ppm的范圍；2）各種小分子中都大量含有氫原子，單一樣品或混合樣品測氫譜的時候，化學(xué)環(huán)境類似的氫出峰會有重疊的情況，彼此干擾很大；3）用于藥物測試時，藥物的賦形劑也會影響核磁出峰。
隨著氟化學(xué)的研究深入，現(xiàn)在每年在研的和上市的小分子藥物中有1/3的都含有氟基團。利用氟譜做晶型分析、反應(yīng)中控、物料衡算等。
關(guān)于利用核磁氟譜的做含量測定也越來越受關(guān)注，氟譜定量理論上有以下幾個優(yōu)點：1）自然豐度高，穩(wěn)定性好，不像碳會不斷衰變，自旋量子數(shù)1/2；2）氟譜對電子環(huán)境變化敏感，化學(xué)位移帶寬超過200ppm，不會像氫譜那樣擁擠在一個狹小的區(qū)間；3）一般無關(guān)的雜質(zhì)、藥物賦形劑中不含氟，對目標(biāo)物的干擾小；4）樣品檢測需求量也很小，<mg級都可以測。
氟譜定量的測定方法和參數(shù)設(shè)定討論：
1. T1弛豫（或縱向弛豫）
90°磁化角（Tip angle）具有最佳的信噪比（S/N）:
2. 測試時間
一般情況下，當(dāng)設(shè)置測試時間為5倍的弛豫時間時，99.33%的弛豫信號（激發(fā)態(tài)回到基態(tài)過程中釋放的能量信號）就可以被收集到。當(dāng)測試時間設(shè)置為8倍弛豫時間信號采集率可以達(dá)到99.97%。比如，一個分子的弛豫時間為1.1s, 弛豫延遲設(shè)置為8.25s，采樣時間1.75，那總的測試時間應(yīng)該就是10s。
3. 采樣時間
采樣時間一般是目標(biāo)產(chǎn)物半峰高線寬的倒數(shù)，比如一個目標(biāo)峰的19F線寬是0.5Hz,采樣時間應(yīng)設(shè)置為2-2.5s為宜。采樣時間不是越長越好，有效的采樣時間可以在信號完全衰減之前盡量收集到有效的衰減信號，當(dāng)信號完全衰減以后，繼續(xù)接受到的無效信號就是噪音了，S/N會降低。
4. 信噪比
一般要求信噪比必須大于150/1才能將檢測的不確定性降低到<1%。
5. 激發(fā)帶寬
前面我們討論過，氫譜的激發(fā)帶寬一般在0-10ppm或0-12ppm，而氟譜的激發(fā)帶寬則可以達(dá)到200ppm。但是，核磁的磁化探頭受到功率限制，是不可能在如此大的帶寬上實現(xiàn)均勻激發(fā)的。一般有四種方法解決這個問題：1）發(fā)射器頻率設(shè)置在目標(biāo)峰的激發(fā)頻率附近；2）生成多個圖譜；3）縮短激發(fā)脈沖的發(fā)射時間，增加帶寬，但是這會犧牲信噪比。4）使用異型波（CHORUS）,有一個前提是底物在異型波的作用下沒有很強的JFF耦合。
6. 瞬態(tài)數(shù)
從一個方向上收集單個瞬態(tài)的信號，可以降低弛豫時間的誤差，但是信號會比較弱，通過多個瞬態(tài)數(shù)據(jù)的疊加可以大大提高信噪比。瞬態(tài)的數(shù)量稱為瞬態(tài)數(shù)n。S/N是關(guān)于n2的函數(shù)，即瞬態(tài)數(shù)越多信噪比越大。（貌似可以通過增加樣品濃度提高n）。
7. 傅里葉數(shù)
比如，我們的測試頻率是100MHZ,在10us的時間里采集了有1000個數(shù)據(jù)點，那么頻域范圍如下：
直接進(jìn)行傅里葉變換，得到如下圖形：
因為參與傅里葉變換的點數(shù)較少，變換后的圖形明顯點數(shù)過于稀松，這時候就會使用“補零”的方法，把數(shù)據(jù)點壓縮在一個更小的讀取窗口里，讓更多的數(shù)據(jù)點參與傅里葉變換。這樣，在沒有增加采樣點和設(shè)備發(fā)射頻率的情況下就能讓取樣點更加集中。下圖是添加了7000個0點以后的圖形。
在進(jìn)行傅里葉變換，圖形就平滑了很多，但是這只是數(shù)字上游戲，騙騙眼睛，對于分真實的核磁分辨率根本沒有任何提高。就像你從近處看紅綠燈是由多個小LED燈組成，他們組成的圓形，邊緣很不光滑成鋸齒狀。然后你就往后退了100米（就是所謂的補零），眼睛再處理這個圖形的時候，紅綠燈的形狀變成了一個規(guī)則的圓形。所以紅綠燈沒變，LED點數(shù)沒有變，“補零”讓你更加“全局”的觀測紅綠燈的形狀而已。
要想正真的提高核磁分辨率，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，最有效的方法還是提高核磁頻率，單位時間內(nèi)發(fā)射更多的脈沖波或者延長采樣時間，采集更多的數(shù)據(jù)點。下圖是延長采樣時間以后，在80us的時間里采集了8000個數(shù)據(jù)點，那么頻域范圍如下：
在進(jìn)行傅里葉變換，圖形的分辨率得到了根本的提升。所以，要想獲得更好、更可靠的核磁數(shù)據(jù)，沒有捷徑，要么花錢更新設(shè)備提高頻率、要么花時間增加采樣點。
8. 氟譜定量的具體方法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法：
所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線法還是要借助特定量的內(nèi)標(biāo)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的積分值和樣品濃度之間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將待測樣品的積分值代入擬合公式計算得到待測樣品的含量。如，下圖是以三氟乙酸為內(nèi)標(biāo)（積分值100），檢測鹽酸氟西汀含量的一個實驗，每一個樣品中的三氟乙酸都是等量的，標(biāo)品含量從0-2.0mmol/L不等，繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合度高達(dá)99.9%（也就是擬合公式的可信度高達(dá)99.9%）。
需要注意的是，1）不是所有的含氟分子都適合做內(nèi)標(biāo)，肯定不能選用與底物反應(yīng)的含氟內(nèi)標(biāo)；2）樣品中內(nèi)標(biāo)的mol濃度和待測樣品要接近，便于積分，減小誤差；3）內(nèi)標(biāo)和樣品的氟信號出峰位置應(yīng)該盡量接近一些（選取相近的氟基團種類：三氟甲基找三氟甲基、氟苯找氟苯等等）。
找到規(guī)律以后，確定某種內(nèi)標(biāo)（比如三氟乙酸）具有普遍的適用性，也可以也不用每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，嘗試直接加內(nèi)標(biāo)定量，多送幾個平行樣確認(rèn)就可以了。
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